「原核转录组测序」

原核生物由于其特殊的结构特征：mRNA常以多顺反子形式存在，5’端没有帽子结构，3’端没有或只有较短的poly(A)尾巴。转录与翻译同时进行，并且大多数原核生物mRNA在转录开始1分钟后就开始降解。

因此与真核生物基于poly(A)尾捕获mRNA的测序原理不同，原核转录组需通过去除核糖体RNA，再进行链特异性建库，从而获得原核生物在某种环境条件下转录出来的所有转录本（包括mRNA，非编码RNA等）的表达量差异信息及功能特征，找到关键的差异功能基因，揭示原核生物不同表型形成的分子调控机制。

「欧易生物优势」

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「技术应用」

• 探究原核生物mRNA在病理或生理中的功能机制研究

• 可用于新药开发，分析抗生素和抗菌剂的作用机制和耐药性

「分析内容」

「结果展示」

「案例分享」

Electron Orbital Hybridization-Enhanced Copper-Nanocatalysis for Anti-Infectio

电子轨道杂交增强铜纳米催化抗感染研究

发表期刊：Advanced Functional Materials | IF：19 | 实验材料：金黄色葡萄球菌

研究内容

复发性细菌感染、难以穿透的微生物生物膜和无法治愈的抗生素耐药性是骨科植入物相关感染（IAIs）最大的威胁。近年来，化学动力学疗法（CDT）被认为是一种很有前景的治疗方法，但现有的CDT药物在生理环境下的治疗效果较低，限制了临床实践。本研究表明，二氧化硅-铜纳米片（Si@Cu NSs）展示了一种光热-化学动力学联合治疗IAIs的策略，并且具有优越的性能和生物相容性。这种独特的设计通过p-d轨道杂交，将铜纳米团簇（Cu NCs）结合在硅纳米片（Si NSs）基体上，使纳米结构具有增强的铜基芬顿样性能，在体外和体内将Si NSs固有的光热性能与Cu NCs对浮游细菌和生物膜的特异性催化抗感染结合起来。

原核转录组测序分析显示，大量产生的反应性氧化物（ROS）通过加强的CDT诱导了细菌的致死氧化应激反应，可以显著抑制细菌耐药和毒力，并有效地预防生物膜重组。本研究不仅揭示了二维纳米催化生物材料具有良好的生物应用前景，也证明了利用轨道杂交技术构建新型CDT试剂催化处理IAIs的可行性。

图 | NSs处理后细菌的原核转录组测序分析

「案例分享」

Nanoadjuvant-triggered STING activation evokes systemic immunotherapy for repetitive implant-related infections

纳米佐剂触发的STING激活提供了一种复发性植入物相关感染的全身免疫疗法

发表期刊：Bioactive Materials | IF：18.9 | 实验材料：金黄色葡萄球菌

研究内容

复发性植入物相关感染（IRIs）是骨科手术中一种具有破坏性的并发症，威胁着植入物的寿命甚至宿主的生命。生物膜会隐藏细菌相关抗原（BAAs），导致类似“冷肿瘤”的免疫沉默微环境，导致IRIs持续存在。为了解决这一挑战，本研究设计了一种含姜黄素和铂的铁基共价有机框架纳米佐剂（CFCP），通过诱导全身免疫反应来实现对IRIs的有效治疗。其中，为了确定CFCP+US（超声）消除生物膜感染的综合机制，对对照组和处理组进行原核转录组测序，发现CFCP+US干扰了金黄色葡萄球菌的物质转运和能量代谢过程，这些过程对于维持正常细菌生长和增殖活动至关重要。

本研究确定了CFCP可以作为一种对植入物进行持续抗菌保护的新辅助免疫疗法，并有望指导临床IRI治疗和复发预防。

图 | CFCP+US释放的铁离子干扰金黄色葡萄球菌生物膜中的细菌代谢

「送样指南」

• 取对数生长期的单菌培养液，测定好菌液浓度，收集含1×108个细菌的菌液体积4℃，3000 rpm离心5 min，尽量弃净上清

• 用无菌水或PBS清洗菌体，去掉培养基，4℃，3000rpm离心5 min，弃上清（可选）

• 将收集有菌体沉淀的样本管置于液氮中速冻5～10 min，再将样本管取出放-80℃保存，干冰运输

• 若所收集样本不是处于对数生长期的菌体，则样本的RNA抽提得率会下降，可按照下列方案送样：①菌体沉淀体积达到0.1 ml；②菌体鲜重100mg

「常见问题」

Q1、原核生物与真核生物在进行转录组测序文库构建时有什么区别?

在原核生物中，mRNA只占全部RNA的1-5%,其余绝大部分是核糖体RNArRNA，因此若要测序mRNA，首先必须先将mRNA纯化出来然而,原核生物并不像真核生物 RNA 具有polyA的结构,无法直接利用oligo-dT将mRNA 纯化出来。如果拿Total RNA进行测序，那么测序的效率一定会非常差，因为大部分的序列都来自rRNA。目前，提高原核生物中mRNA的量，最主要的方式是去除Total RNA中的rRNA。

Q2、生物学重复是必须的吗？一般要重复几次？

是的。一般应该重复 3 次以上，具体情况需要根据具体实验来决定。样本数量越多统计学意义越大。

Q3、一般来说，FPKM值多大算表达量高的?

FPKM值和物种，以及和不同的发育生长时期都是有关系，没有一个绝对的标准。根据文献中的报道，一般认为0.5以下的至少受测序误差影响比较大，可以认为是没有表达，0.5-1属于低丰度表达基因；1-10属于中低丰度表达基因；10-50以上属于中高丰度表达基因；50以上属于高丰度表达基因。该标准仅供参考。

Q4、转录组测序需要多少测序量？

由于转录组测序需要进行表达量的分析，因此不推荐使用覆盖度，在确定测序量时，我们以产生的reads数作为依据。转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响，不同物种间变化很大。因此在测序之前，需要对转录组的大小进行评估。针对有参考基因组的物种，可通过分析基因组信息，统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章；针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。